MUG 4-甲基傘型酮-beta-D-葡糖苷酸/GUS熒光底物

——轉基因植物最常用報告基因GUS熒光顯色底物，GUS活性定量分析

搜索關(guān)鍵詞：β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase，GUS）,藍色熒光底物,轉基因植物GUS表達, GUS活性（定量）,報告基因gusA（uidA）, X-Gluc,CAS：6160-80-1或881005-91-0

作用機制：

MUG，英文全名4-Methylumbelliferyl beta-D-glucuronide，中文全名4-甲基傘型酮-beta-D-葡糖苷酸，CAS：6160-80-1或881005-91-0，一種最常用的β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase，GUS）的熒光顯色底物。GUS可水解MUG生成4-MU（4-甲基傘型酮）和β-D-葡萄糖醛酸。4-MU中的羥基解離后在紫外光的激發(fā)下能產(chǎn)生藍色熒光（Ex= 365nm，Em= 445nm）。GUS由大腸桿菌來(lái)源的報告基因gusA（uidA）所編碼，經(jīng)常用來(lái)檢測飲用水是否受大腸桿菌污染，以及用來(lái)對血液培養制品快速鑒定細菌污染情況。MUG作為熒光底物非常適合用在植物分子遺傳學(xué)研究來(lái)檢測各種啟動(dòng)子驅動(dòng)下的GUS基因表達量。MUG不僅能很好的測定植物裂解液和葉盤(pán)的GUS表達活性，且適用于全植物表達活性分析。

主要應用：

1. 轉基因植物報告基因GUS活性檢測，MUG用作熒光顯色底物。

普遍應用優(yōu)勢在于：絕大多數植物細胞內不存在內源性的GUS活性，而且GUS基因表達產(chǎn)物具有檢測方法簡(jiǎn)單、靈敏度高，易于定量及定性分析，能夠與其他蛋白質(zhì)基因融合等優(yōu)勢，因此，GUS基因為植物工程研究中應用最廣泛的報告基因（報道基因）之一。

GUS活性檢測（熒光分析法，定量研究）

GUS催化熒光底物MUG 4-甲基傘型酮-beta-D-葡糖苷酸，將其水解為4-MU（4-甲基傘型酮）和β-D-葡萄糖醛酸。4-MU中的羥基解離后在365nm的光激發(fā)下產(chǎn)生455nm的熒光。此時(shí)用熒光分光光度計測定得到的是相對值，因此同時(shí)需要用標準物4-MU進(jìn)行校準。

熒光定量分析GUS活性有兩種基本方法：1）在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定GUS酶作用產(chǎn)物的總熒光量，需要設定空白對照，以消除內源熒光強度；2）測定一段時(shí)間內GUS的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。在酶反應初始階段，酶作用產(chǎn)物與時(shí)間呈線(xiàn)性關(guān)系，而內源性熒光物質(zhì)的熒光量與時(shí)間無(wú)線(xiàn)性關(guān)系。由此可計算GUS酶活力。GUS酶活性通常以μg MU/min/mg蛋白質(zhì)。有時(shí)也可以用樣本的鮮重來(lái)表示。

1.1 檢測步驟【僅作參考，根據具體實(shí)驗條件做適當調整】

a）取約100mg愈傷組織或一片新鮮葉盤(pán)于1.5ml離心管內，加入100μl萃取緩沖液（extraction buffer）內勻漿?？杉尤肷倭可匙踊虿Ａе樘岣哐心バ?。

萃取緩沖液（extraction buffer）配方：50mM磷酸鹽緩沖液（pH 7.0），10mM DTT，1mM Na2EDTA，0.1%十二烷基肌氨酸，0.1% Triton X-100

b）4°C，15,000rpm離心5min。收集上清轉移到另一干凈的1.5ml離心管，冰上放置待用。

c） 取50μl上述萃取上清到0.5ml 37°C預熱的反應緩沖液（Assay buffer）；用移液槍吹勻或漩渦混勻。

反應緩沖液（Assay Buffer）：稱(chēng)取17.6mg MUG溶于50ml萃取緩沖液，此時(shí)即為1mM MUG反應液。4°C保存，2周穩定。

d）在某一時(shí)間段內（高GUS活性樣本30min；或低GUS活性1h-過(guò)夜；）吸取100μl溶液到含900μl終止液（Stop Buffer）的1.5ml離心管內，做好標記。有可能采集3-4個(gè)時(shí)間點(diǎn)和過(guò)夜孵育的時(shí)間點(diǎn)熒光量?！居脽晒夥止夤舛扔嬙诩ぐl(fā)波長(cháng)365nm、發(fā)射波長(cháng)455nm下，狹縫10nm時(shí)測定不同時(shí)間點(diǎn)的熒光強度值?！?/span>

終止緩沖液（Stop Buffer）：溶解21.2g無(wú)水碳酸鈉到800ml去離子水，充分溶解，定容至1L，此時(shí)即為0.2M Na2CO3溶液。

e）以熒光強度值對反應時(shí)間作曲線(xiàn)，求出單位時(shí)間的熒光強度變化。用單位時(shí)間的熒光強度變化除以參加反應的蛋白量，求出單位質(zhì)量的蛋白單位時(shí)間的熒光強度變化。

2. 鑒定和分離大腸桿菌污染

本MUG瓊脂培養基用來(lái)食物或藥品內大腸桿菌的鑒定和分離。

2.1 按照以下步驟配制培養基，

2.2 121℃高壓滅菌15min；

2.3 冷卻至50℃，搖勻后倒入平板，無(wú)菌超凈臺內使其冷卻。

2.4 結果分析：鏡檢發(fā)現淺藍色熒光，表明樣本受大腸桿菌（E. Coli）污染。樣本涂布到平板上培養24h，鏡檢若是沒(méi)有發(fā)現熒光，需繼續培養24h，再次檢測熒光以確認污染情況。

基本特性：

1）CAS NO：46160-80-1

2）同義名：4-Methylumbelliferylβ-D-glucuronide4-甲基傘型酮-β-D-葡糖苷酸；4-MUG；

3）分子式：C16H16O9

4）  分子量：352.29 g/mol（anhydrous）

5）  純度：≥98%（HPLC）

6）  外觀(guān)：白色或近白色粉末

7）  溶解性：溶于水（0.35mg/ml），溶于0.1M Sorensen’s buffer（0.1 mM）

8）  化學(xué)結構：

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注意事項

為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

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