X-α-Gal（α-半乳糖苷酶顯色底物/酵母雙雜交檢測）

— —酵母雙雜交檢測系統/蛋白-蛋白相互作用分析

搜索關(guān)鍵詞：

X-α-Gal 5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷；α-半乳糖苷酶 a-galactosidase；MEL1基因；GAL4 酵母雙雜交系統；CAS：107021-38-5；藍白斑篩選；

基本描述：

X-α-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷，CAS：107021-38-5），一種用來(lái)檢測α-半乳糖苷酶（也稱(chēng)為蜜二糖酶，α-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，EC 3.2.1.22）活性的顯色底物。X-α-Gal的使用，避開(kāi)雙雜交分析中β-半乳糖苷酶溶液制備和濾膜提升實(shí)驗（filter-lift assay）的繁瑣操作，只需直接添加在培養基上，通過(guò)藍色沉淀的生成與否，即可用來(lái)檢測雙雜交相互作用。X-α-Gal可用來(lái)區分腸桿菌科內的不同物種以及劃分乳酸菌和雙歧桿菌。組織學(xué)研究中，X-α-Gal還可借助光學(xué)顯微鏡來(lái)檢測組織的α-半乳糖苷酶活性。

利用α-半乳糖苷酶水解二糖-蜜二糖作為碳源，酵母菌得以正常生長(cháng)或進(jìn)行發(fā)酵。釀酒酵母菌內，該酶由幾種GAL基因調控的MEL1基因所編碼。一旦GAL4激活，α-半乳糖苷酶分泌，之后水解培養基上的X-α-Gal，使得菌落產(chǎn)生藍斑。酵母雙雜交研究用的工程菌包括AH109，PJ69-2A，Y190和Y187。

X-α-Gal優(yōu)勢：

避開(kāi)雙雜交分析中β-半乳糖苷酶溶液制備和濾膜提升實(shí)驗（filter-lift assay）的繁瑣操作，只需直接添加在培養基上，通過(guò)藍色沉淀的生成與否，即可用來(lái)檢測雙雜交相互作用。

X-α-Gal與酵母雙雜交系統：

酵母雙雜交篩選是體內用來(lái)檢測蛋白-蛋白相互作用的一種遺傳分析實(shí)驗，此方法由Prof. Stan Fields及合作者開(kāi)發(fā)用來(lái)調查兩個(gè)已知蛋白的相互作用，另一個(gè)重要應用是從文庫內篩選并鑒定某一特定蛋白的未知結合蛋白。陽(yáng)性克隆也就是那些能夠激活報告基因轉錄子，使得營(yíng)養缺陷型酵母雙雜交菌株在營(yíng)養缺陷選擇性培養基上生長(cháng)的菌落。大多數雙雜交方法使用大腸桿菌的LacZ基因作為第二個(gè)報告基因，通常要使用非常耗時(shí)的filter-lift assay來(lái)鑒定能在第二種選擇性平板上生長(cháng)的菌落。而替換使用的X-α-Gal，可直接在營(yíng)養缺陷性的選擇培養基上來(lái)檢測基于GAL4-轉錄子的雙雜交作用。

基本特性：

1）  CAS NO：107021-38-5

2）  化學(xué)名：5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-α-D-galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷；X-α-D-Galactoside X-α-D-半乳糖苷；

3）  分子式：C14H15BrClNO6

 4）分子量：408.64g/mol

5）純度：≥98%（TLC）

6）外觀(guān)：白色或近白色結晶粉末

7）化學(xué)結構：

使用方法【懋康整理】

方法1：直接倒入固體培養基

1）  溶解60mgX-α-gal于3ml DMF得20mg/ml儲存液，馬上使用或者避光儲存于-20℃，6個(gè)月穩定；

2）  將高壓滅菌好的瓊脂培養基于室溫冷卻至50℃；

3）  按照每升培養基加入1ml 20mg/mlX-α-gal儲存液的用量，直接加入冷卻好的瓊脂培養基；【若有需要，此時(shí)也可加入篩選用的抗生素】；

4）  倒平板，使用前必須讓培養基室溫凝固（通常至少需30min）。

方法2：涂布于預制培養平板上

1）  溶解24mg X-α-gal于6ml DMF得4mg/ml儲存液，馬上使用或者避光儲存于-20℃，6個(gè)月穩定；

2）  超凈工作臺內放置已經(jīng)倒好的固體培養基，使其表面干燥；

3）  吸取200μl (15cm平板) 或100μl（10cm平板）4mg/ml X-α-gal 儲存液于預制培養平板上，并涂布使其均勻分散在表面【注意：平板邊緣通常很難得以充分涂布，可能導致假陽(yáng)性克隆生成。建議條件可能下，于平板中央挑取克隆】。

4）  使用前將上述涂布好的篩選平板于超凈工作臺內，至少晾干30min；

5）  將轉化好的細菌或酵母涂于平板上，分別置于37℃或30℃倒置培養，直至藍色菌落出現。

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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