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        CCK-8細胞增殖和毒性檢測試劑盒常見問題FAQs
        時間:2018-11-06     作者:懋康原創     文章來源:懋康生物    

        CCK-8 Frequently Asked Questions:


        1. CCK-8與其他細胞增殖-毒性檢測方法的優勢在哪里?

                     檢測方法

        特征比較

        MTT法

        XTT法

        WST-1法

        CCK-8法

        甲臢產物的水溶性 

        差,需有機溶劑溶解后再檢測  

        產品性狀

        粉末

        2瓶溶液

        單瓶溶液(或粉末+溶液) 

        單瓶溶液

        使用方法

        配成溶液后使用

        現配現用

        即開即用(或現配現用)

        即開即用

        檢測靈敏度

        很高

        很高

        非常高

        檢測時間

        較長

        較短

        較短

        最短

        檢測波長

        560-600nm

        420-480nm

        420-480nm

        430-490nm

        細胞毒性

        高,細胞形態完全消失

        很低,細胞形態不變   

        很低,細胞形態不變

        很低,細胞形態不變

        試劑穩定性

        一般

        較差

        一般

        很好

        批量樣品檢測

        可以

        非常適合

        非常適合

        非常適合

        便捷程度

        一般

        便捷

        便捷

        非常便捷


        2. 單孔接種多少個細胞?

        當使用96孔板時,貼壁細胞的最小接種量至少為1000個/孔(100μL培養基)。檢測白細胞的靈敏度相對較低,因此建議接種量不低于2500個/孔(100μL培養基),建議先做幾個孔摸索接種細胞的數量。若使用24孔板或6孔板,請先計算每孔相應的接種量,然后按照每孔培養基總體積的10%加入CCK-8。


        3. 如何設定空白對照?

        在不含細胞的培養基中加入CCK-8,測定450nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗(細胞毒性實驗)時,還應考慮藥物的吸收,可以在不含細胞、加入藥物的培養基中加入CCK-8,測定450nm的吸光度作為空白對照。


        4. 哪些物質會影響CCK-8的測定?

        當有還原性物質存在時會增加CCK-8的測定,增加OD值;當有氧化性物質存在時會抑制測定反應的發生,降低OD值。在有酚紅存在的情況下,會增加空白吸收,但不影響測定,扣除空白吸收即可。


        5. 做加藥實驗時,藥物對測定是否有影響?如何解決?

        有時會有影響。如果藥物具有還原性就會和CCK-8發生顯色反應,增加OD值。解決方法:首先要確認藥物是否有吸收,在含有藥物的培養基中加入CCK-8,測定450nm的吸光度。如果它的吸光度比不含藥物的培養基(只加CCK-8)的吸光度高,則說明藥物有影響,可在加CCK-8之前更換培養基,去掉藥物的影響。


        6.   CCK-8對細胞的毒性大小如何?

        CCK-8對細胞毒性相當低,同樣的細胞在CCK-8檢測后還可用于其他細胞增殖的檢測實驗,比如結晶紫檢測法,中性紅檢測法或DNA熒光檢測法等。由于每種細胞對CCK-8的耐受力不同,因此若需要長時間孵育,先檢測下細胞在加入CCK-8后的活力。


        7. 如果沒有450nm的濾光片,還可以使用哪些其他濾光片?

        還可使用430-490nm之間的濾光片,但450nm濾光片的檢測靈敏度最高。


        8. CCK-8能否對活細胞進行染色?

        不能。因為CCK-8的主要成分是一種水溶性四唑鹽(WST-8),并通過電子載體1-methoxy PM將活細胞中的電子交換到培養基中的WST-8上,因WST-8及其生成的甲臢染料是高度水溶性的,不會進入細胞內,所以CCK-8不能對活細胞進行染色。


        9.  須設定參比波長?設定參比波長的目的是什么?

        不一定,CCK-8在參比波長處沒有吸光度。設定參比波長的目的是為了去除由于樣品渾濁產生的吸收。


        10. 每次測定的數值不一樣,是什么原因?如何解決?

        可能存在以下幾個原因:a)當在培養箱內培養時,培養板最外一圈的孔最容易干燥揮發,由于體積不準確而增加誤差。通常情況最外一圈孔只加培養基,不作為測定孔用;b)有可能因為CCK-8沾在壁上而產生誤差,建議在加入CCK-8,輕輕敲擊培養板以幫助混勻;c)每孔的細胞數量過多或過少。請預先在1000~100,000個/孔范圍內摸索條件。


        11. 如果OD值太低,可以采取什么辦法?

        可采取2種辦法:a)適當增加細胞數量;b)延長加入CCK-8后的孵育時間。


        12. 如果OD值太高,但不能減少細胞數量,如何解決?

        可以縮短加入CCK-8后的孵育時間。比如,可以把加入CCK-8后的孵育時間由原來的3h縮短到2h。


        13. CCK-8顯色過程種如何終止反應?

        有以下幾種方法(96孔板):a)顯色反應后,將培養板置于4℃冰箱;b)每孔加10 μL0.1M的HCL溶液;c)每孔加10 μL 1% w/v SDS溶液。反應終止后請在24h內測定OD值。


        14. 必須預培養細胞嗎?

        不一定。如果需要保持細胞的最佳狀態,建議預培養細胞。如果不做預培養,細胞內的脫氫酶可能會不穩定。有的科研人員不做預培養,但做標準曲線和檢測時需要統一檢測條件。


        15. 預培養后,更換培養基需要細胞計數嗎?

        一般情況下用胰蛋白酶處理對數增長期的細胞,用血球計數板計數,制備成一定濃度的細胞懸液即可。如果想要精密計數細胞的話,可以預培養后取培養基用血球計數板進行計數。


        16. CCK-8對于不同的細胞靈敏度是否一樣?

        不一樣。懸浮細胞相比較難染色。對于貼壁細胞,一般加入CCK-8后1-4h吸光度已經很高,但對于懸浮細胞則可能吸光度較低,可以通過延長CCK-8的染色時間或增加細胞數量來解決。


        17. 懸浮細胞和貼壁細胞在數量上有何區別?

        懸浮細胞由于染色比較困難,一般需要增加細胞數量和延長培養時間。貼壁細胞染色比較容易,若細胞數量過大,有時吸光度會超過酶標儀的讀數。 


        18. 應該每次做標準曲線嗎?

        建議每次都做。雖然細胞相同,但是細胞狀態不一樣。對于狀態不一樣的細胞建議每次做標準曲線。如果試劑的批號不一樣,靈敏度可能有輕微的差異,此時也建議分別做標準曲線。


        19. 實驗之前是否需要先檢測以下培養基和CCK-8之間是否有反應?

        建議使用一個孔做下檢測,因有時培養基種可能含氧化還原物質。正式實驗之前有必要先確認下培養基和CCK-8是否有反應。一般正常的OD值應該在0.4以下。


        20. 有時在藥物作用下,細胞已經死亡,但脫氫酶的活性還在,是否能計算細胞數量?

        不能。由于CCK-8是通過和細胞內的脫氫酶進行反應間接反應活細胞數量。如果細胞已經死亡,即使脫氫酶的活性還有,測定出來的細胞數量將會比真實值高,不能反應真實的活細胞數量,建議采用別的方法測定。


        21. 可否使用384孔板進行實驗?

        可以。向每孔加入培養基總體積10%的CCK-8。如果加入CCK-8體積太少,可以先將CCK-8稀釋一倍,然后加入培養基總體積20%的量。


        22. CCK-8與胸苷結合檢測之間是否有相關性?

        有。但請注意由于CCK-8使用的檢測原理與胸苷檢測的不同,因此,結果可能不同。


        23. CCK-8能否檢測細菌細胞?

        可以檢測大腸桿菌,但不能檢測酵母細胞。向每孔100μL大腸桿菌培養液中加入10μL CCK-8,培養1-4h或過夜。


        24. 如果加入藥物中含有金屬,是否有影響?

        金屬對CCK-8顯色有影響。當終濃度為1mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅分別會抑制5%、15%、90%的顯色反應,使得靈敏度降低。如果終濃度是10mM,將會100%抑制。


        25. CCK-8的穩定性如何?

        CCK-8在2-8℃能穩定保存1年,推薦用此方法檢測;長期不用也可置于-20℃穩定保存2年。


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        Cell Counting Kit (CCK-8) 細胞增殖及毒性檢測試劑    

        MX3008-1ML       

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        Cell Counting Kit (CCK-8) 細胞增殖及毒性檢測試劑

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