Luc 報告基因底物/ D-Luciferin D-螢火蟲(chóng)熒光素鉀鹽

活體成像研究/體外生物發(fā)光研究/轉錄水平研究

搜索關(guān)鍵詞：

Luc reporter gene 報告基因；In vivo imaging 活體成像研究；轉錄水平研究；熒光素酶/ATP水平研究；報告基因質(zhì)粒；報告基因病毒顆粒；螢火蟲(chóng)熒光素；甲蟲(chóng)熒光素；CAS：115144-35-9；

基本描述：

D-熒光素（D-Luciferin）是熒光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍用于整個(gè)生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是體內活體成像技術(shù)。作用機制是在A(yíng)TP和熒光素酶的作用下，D-熒光素（底物）被氧化發(fā)光。當熒光素過(guò)量時(shí)，產(chǎn)生的光量子數與熒光素酶的濃度呈正相關(guān)性（見(jiàn)下圖）。將攜帶熒光素酶編碼基因（Luc）的質(zhì)粒轉染進(jìn)入細胞后，導入研究動(dòng)物如大小鼠體內，之后注入熒光素，通過(guò)生物發(fā)光成像技術(shù)（BLI）來(lái)檢測光強度變化，從而實(shí)時(shí)監測疾病發(fā)展狀態(tài)或藥物的治療功效等。也可以利用ATP對此反應體系的影響，根據生物發(fā)光強度的變化來(lái)指示能量或生命體征。

基本應用：

D-熒光素也常用于體外研究，包括熒光素酶和ATP水平分析；報告基因分析；高通量測序和各種污染檢測。

常見(jiàn)商業(yè)化類(lèi)型的差異（熒光素鉀，鈉，游離酸）：

目前市場(chǎng)上有三種產(chǎn)品形式，D-熒光素（游離酸），D-熒光素（鈉鹽），和D-熒光素（鉀鹽）。這三種產(chǎn)品主要差別在于溶解特性。

1）D-熒光素（游離酸）在水以及緩沖體系內的溶解性都很弱，除非溶于弱堿如NaOH和KOH溶液。溶于甲醇（10 mg/ml）和DMSO（50 mg/ml）。

2）D-熒光素（鈉鹽）和D-熒光素（鉀鹽）能夠非常容易且快速的溶入水或者緩沖液中，使用方便，溶劑無(wú)毒性，特別適合體內實(shí)驗。配成溶液后的三種產(chǎn)品，在絕大多數應用上都沒(méi)有實(shí)質(zhì)性的差別。

3）D-熒光素（鈉鹽）和D-熒光素（鉀鹽）基本上沒(méi)有差別，主要是使用習慣等因素影響。整體來(lái)看，鉀鹽的應用文獻明顯多于鈉鹽。

D-熒光素鉀鹽基本特性：

1）CAS NO：115144-35-9

2）化學(xué)名：4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt,D-Luciferin firefly, potassium salt

3）分子式：C11H7N2O3S2K

4）分子量：318.42 g/mol

5）純度：＞99% (HPLC)，分子生物學(xué)級（超純）

6）外觀(guān)：淺黃色至黃色粉末

7）溶解性：溶于水（60 mg/ml）

使用方法：

A．體外生物發(fā)光檢測

1）儲存液制備

用蒸餾水溶解D-熒光素（鉀鹽），配制成15mg/ml的儲存液（100×），混勻后立即使用或分裝于-20℃或-80℃凍存，避免反復凍融。建議使用的工作液濃度為150μg/ml（相當于468μM）。

2）熒光素酶反應緩沖液制備

配方【1×，參考Yuichi Oba, et al., 2003】：100mM Tris-HCl（pH 7.8），5mM MgCl2，250μM CoA，150μM ATP。具體緩沖液組成可參考其他文獻資料來(lái)調整。按照以上配方制備熒光素酶反應緩沖液（2×）。

3）收集細胞裂解上清（熒光素酶表達）

根據需要檢測的細胞類(lèi)型，選擇合適的裂解液進(jìn)行細胞裂解，離心收集上清后續檢測待用。

4）螢火蟲(chóng)熒光信號檢測

【注①】：螢火蟲(chóng)熒光信號的檢測方法大體上取決于冷光測定儀（luminometer）類(lèi)型（是手動(dòng)型熒光計、單管注射型或者酶標板讀數型熒光計）。根據特定發(fā)光測定儀，來(lái)考慮注射用量和程序設置。

【注②】：需設置不含熒光素酶的孔（用作陰性對照），以測定背景熒光。

例：注射式冷光測定儀（injectible luminometer，單樣或微孔板，200μl終體積）

a）吸取100μl熒光素酶反應緩沖液（2×）到一干凈的冷光測定儀比色皿或96孔板的各孔（最好使用全白平底的96孔板）；

b）吸取50~98μl裂解上清到皿或孔內；

c） 如果有需要，用水來(lái)補足使得總體積到198μl；

d）設置程序注射2μl熒光素儲存液（使工作濃度150μg/ml），程序：2~5秒延遲（delay），之后10s測定。

B．活體成像分析

1）用無(wú)菌的PBS（w/o Mg2+）或者DPBS（w/o Mg2+）配制D-熒光素（鉀鹽）工作液（15mg/ml），0.2μm濾膜過(guò)濾除菌?；靹蚝罅⒓词褂没蚍盅b于-20℃或-80℃凍存，避免反復凍融。一旦使用，放到4℃解凍，保持冰冷且避光。

2）注射量取決于注射方式，具體如下：

3）注射入體內10-20 min（待光信號達到最強穩定平臺期），再進(jìn)行成像分析。

注：建議對每只動(dòng)物模型都需要建立熒光素酶動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)，從而確定最高信號檢測時(shí)間和信號平臺期。

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注意事項

為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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