AO/EB Double Staining Kit AO/EB雙染試劑盒

關鍵詞：

吖啶橙（Acridine Orange，AO）；溴化乙錠（Ethidium Bromide, EB）；Apoptotic cell凋亡細胞；Necrotic cells壞死細胞；Annexin V/PI細胞凋亡雙染；

產品信息

產品描述

吖啶橙（Acridine Orange，AO）是一種異染的核酸結合染料，具細胞膜滲透性，通過插入或靜電吸引的方式與DNA或RNA結合。當與雙鏈DNA（dsDNA）結合發射綠色熒光（Ex/Em=502/525nm），與單鏈DNA（ssDNA）或RNA結合發射紅色熒光（Ex/Em=460/650nm），少量結合呈橙紅色熒光。溴化乙錠（Ethidium Bromide, EB）是一種多環芳烴熒光小分子和核酸插入劑，嵌合到雙鏈DNA或RNA的堿基對內，無堿基特異性，呈紅色熒光（（Ex/Em=518/605nm）。EB不具細胞膜滲透性。

吖啶橙（AO）和溴化乙錠（EB）常常聯合使用來觀察細胞核變化和凋亡小體形成，這些都是凋亡的特征。兩者結合能區分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞。工作原理在于吖啶橙能同時染活細胞和死細胞，EB只能對喪失膜完整性的細胞進行染色?；罴毎示鶆虻木G色。早期凋亡細胞呈綠色，并且在細胞核能看到亮綠色的點，由于染色體濃縮和核斷裂。晚期凋亡細胞也會被EB著色，從而染成橙紅色，但，與壞死細胞相比，晚期凋亡細胞會有濃縮和常常斷裂的核。壞死細胞也被染成橙紅色，但會有和活細胞相似的核形態，沒有濃縮的染色體。

我司（懋康生物）提供的AO/EB雙染試劑盒（AO/EB Double Staining Kit）提供完整的試劑，操作簡單，根據說明書操作能做100個反應。

產品包裝

保存與運輸方法

保存：4-25℃避光保存，詳見瓶上標簽。1年有效。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1）AO與EB都有一定毒性，請小心操作。

2）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

1.染色工作液的制備

于正式實驗前，取吖啶橙染液（試劑A）、溴化乙錠染液（試劑B）、稀釋緩沖液（試劑C），按照A:B:C=1:1:8的比例稀釋成所需的AO/EB染色工作液。

2.細胞準備

貼壁細胞：按照常規方法消化。于1000rpm離心5min，收集細胞沉淀，用PBS清洗一次。

懸浮細胞：于1000rpm離心5min，收集細胞沉淀，用PBS清洗一次。

之后用稀釋緩沖液（試劑C）重懸細胞，細胞計數，調整細胞密度為0.5-5×106個/ml。

3.染色

每25μl細胞懸液中，加入2μl新鮮制備的AO/EB染色工作液，輕輕混合均勻。室溫孵育5~10min。

4.觀察

取干凈載玻片，滴加5~10μl染色的細胞懸液，蓋上蓋玻片。使用熒光顯微鏡的熒光素濾片和60倍放大的物鏡來觀察和計數。該測定至少重復三次，每次觀察的總細胞至少100個。

【注意】：根據細胞類型選擇理想的物鏡放大倍數（更高或更低），前提是必須看清核形態。

應用示例（來自文獻）：

文獻：Dual AO/EB Staining to Detect Apoptosis in Osteosarcoma Cells Compared with Flow Cytometry.

染色方法：Dual fluorescent staining solution (1 μl) containing 100 μg/ml AO and 100 μg/ml EB (AO/EB) was added to each suspension and then covered with a coverslip. The morphology of apoptotic cells was examined and 500 cells were counted within 20 min using a fluorescent microscope (OLYMPUS). Dual acridine orange/ethidium bromide (AO/EB) staining method was repeated 3 times at least.

Fig. (A)陰性對照細胞（正常細胞）：環形細胞核均勻分布在細胞中央。(B)實驗組(早期凋亡細胞):吖啶橙（AO）染色后的細胞核呈黃綠色熒光，以月牙形或顆粒的形態聚集位于細胞的一邊。(C)實驗組(晚期凋亡細胞):經EB染色后的細胞核呈橙紅熒光，集中聚集且偏重定位。(D)壞死細胞：壞死細胞體積增加，顯示平整的橙紅色熒光和不清晰的輪廓。細胞正要溶解或接近崩潰。

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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