DiI (DiIC18(3)) 細胞膜橙紅色熒光探針（神經元示蹤研究）

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溫馨提示：見細胞膜熒光探針專題，選擇你想要的最適膜標記探針。

關鍵詞：細胞膜熒光探針，DiI，DiO，DiD，DiR，DiA，CM-DiI，神經示蹤，傳統細胞膜熒光探針

訂購信息：

產品描述：

DiI, DiO, DiD和DiR作為一類長鏈的親脂性二烷基碳菁類染料（Dialkylcarbocyanines）熒光染料家族，用于標記細胞膜以及其他脂溶性生物結構。作為一類環境敏感型熒光染料，當它們與膜結合或者與親脂性生物分子（例如蛋白質，雖然在水中其熒光強度很弱）結合時，其熒光強度顯著增強。一旦進入細胞后，它們在細胞內質膜中逐步擴散，于最佳濃度條件下可將整個細胞均勻染色。這些染料具很高的淬滅系數，偏光依賴性和很短的激發壽命。

四種染料呈現不同的熒光顏色，DiI（橙色熒光）、DiO（綠色熒光）、DiD（紅色熒光）、DiR（深紅色熒光），為活細胞多色彩熒光成像分析和流式細胞術提供了一種便捷的工具。DiO和DiI分別用標準FITC和TRITC濾光器檢測，可結合使用。其中，DiI及其衍生物由于極其低的細胞毒性，應用最為廣泛。不僅普遍用于活體和固定組織及細胞的神經元逆行性和順行性示蹤分析，還可以用于檢測細胞的融合和粘附，檢測發育或移植過程的細胞遷移，通過FRAP（熒光光漂白恢復技術）檢測脂質在細胞膜上的擴散過程，檢測細胞毒性，以及標記脂蛋白如LDL和HDL等。

本品以DiI的高氯酸鹽形式提供，英文全名：1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，CAS NO.41085-99-8，純度≥95%（TLC），適用于熒光檢測研究。

DiI橙紅色熒光探針基本特性：

1） 同義名：DiI perchlorate; DiIC18(3);1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate;

2） CAS NO：41085-99-8

3） 分子式：C59H97ClN2O4

4） 分子量：933.87 g/mol

5）純度：≥95%（TLC）
6）溶解性：溶于DMF，DMSO，甲醇
7）外觀：紅色至暗紅色，紫色至深紫色粉末
8）Ex/Em：550/567 nm（in phosphate buffer/SDS pH 7.0）
9） 推薦濾光器：Omega- XF108, XF32, Chroma-41002, 31002
10）化學結構圖：

保存與運輸方法

保存：4oC干燥避光保存，有效期一年。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1）熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

 使用方法

【注意】以下使用方法僅用作參考，可根據具體的實驗條件做出調整。

1.染色液制備

1）儲存液制備：用DMSO或乙醇配置濃度1～5 mM的儲存液。例如，取5mg DiI（Mw：933.87 g/mol）溶于1.07ml無水DMSO中，充分溶解，即得到5mM的儲存液?！咀⒁狻课词褂玫膬Υ嬉悍盅b儲存在-20℃，避免反復凍融。

2）工作液制備：用合適的緩沖液（如：無血清培養基，HBSS或PBS）稀釋儲存液，調整到1～5 μM的工作濃度?！咀⒁狻抗ぷ饕鹤罱K濃度需要根據不同細胞系和實驗體系來優化。建議從推薦濃度開始，以10倍范圍為區間進行最優濃度的摸索。

2.懸浮細胞染色

1）加入適當體積的染色工作液重懸細胞，使其密度為1×106/mL。

2）37℃孵育細胞2～20min，不同的細胞最佳培養時間不同?？梢?0min作為起始孵育時間，之后優化以保證得到均一化的標記結果。

3）孵育結束，按1000～1500 rpm離心5min。

4）去除上清液，之后輕柔加入37℃預熱的生長培養液重懸細胞。

5）再重復3），4）步驟兩次。

3.貼壁細胞染色

1）將貼壁細胞培養于無菌蓋玻片上。

2）從培養基中移走蓋玻片，濾掉過量培養液，將蓋玻片放在潮濕的小室內。

3）在蓋玻片的一角加入100μL的染色工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細胞。

4）37℃孵育細胞2～20min，不同的細胞最佳培養時間不同?？梢?0min作為起始孵育時間，之后優化以保證得到均一化的標記結果。

5）吸掉染色工作液，用培養液洗蓋玻片2～3次，每次用預溫的培養基覆蓋所有細胞，孵育5～10min，然后吸走培養基。

4.顯微鏡檢測

1）DiD，DiO，DiI，DiR和DiS濾光器的選擇參見下表：

2）多色染料的同時檢測，濾光器按照以下設定：

a) DiI和DiO＝Omega XF52，Chroma 51004；

b) DiI和DiD＝Omega XF92，Chroma 51007；

c) DiI，DiO和DiD＝Omega XF93，Chroma 61005；

5.流式細胞儀檢測

經DiO，DiI，DiD和DiR染色的細胞分別用流式細胞儀的FL1，FL2，FL3或FL4通道檢測。

應用示例（來自文獻）：

文獻一、Wexler-Cohen Y et al. Membrane-Anchored HIV-1 N-Heptad Repeat Peptides Are Highly Potent Cell Fusion Inhibitors via an Altered Mode of Action. PLoS Pathog. 2009 Jul;5(7):e1000509.

使用方法（Cell-Cell Fusion Inhibition Assay）：

Jurkat E6-1 and Jurkat HXBc2 cells were labeled with DiI and DiD lipophilic fluorescent probes, respectively. The two cell populations were co-incubated, in a ratio of 1∶1, for 6 h in the presence of eight different concentrations of the inhibitory peptides.Prior to measurements the cells were washed, spinned, dissolved in PBS, and put on ice. Cells co-incubated without the presence of peptides served as an optimal fusion reference. Unlabeled cells that were handled similarly served as an intrinsic fluorescence control.

Cells labeled separately with DiI or DiD were used to adjust the optimal separation of fluorescent signals. Jurkat HXBc2 cells labeled with DiI were co-incubated with Jurkat HXBc2 cells labeled with DiD for a fusion background that was subtracted from the measurements of the experiment.The following alterations were applied to the original protocol: (i) 5 μL of a 1 mg/mL DiI or DiD solution in dimethylsulfoxide (DMSO) was added to 1 mL of 4×106 cells/mL Jurkat E6-1 or Jurkat HXBc2 cells, respectively.(ii) For each data point 150,000 events were collected. Measurements were performed on a FACSort machine, upgraded to a FACSCalibur cell analyzer (Becton Dickinson).

文獻二、Mazzoni M et al. Distribution, organization and innervation of gastric MALT in conventional piglet. J Anat. 2011 Nov;219(5):611-21.

使用方法（Tissue preparation and DiI tracing in fixed tissue）：

Small crystals of DiI were diluted at 3% in 100% ethanol and evaporated onto small glass beads (about 200 μm). The glass beads were placed in the middle of the gastric folliclesto detect if neurones projecting to the follicles were present. In other samples, after gently removing the overlying epithelium by the use of entomological forceps, glass beads were inserted into the lamina propria to identify whether neurones projecting to the mucosal layers were present.

Fig 1. Tangential sections of pig gastric mucosa at the level of the diverticulum.(A) Stereomicroscopy showing DiI‐coated beads (arrow) applied to a follicle in fixed tissue after 8 months of incubation. (B,C,E) DiI crystals applied to the follicles; note that the tracer was homogeneously distributed inside the follicles. (B) Labelled neurones (arrowhead) and processes entering the labelled follicle. (C) Polyhedral‐labelled neurone (arrowhead) more than 400 μm from a labelled follicle. (D) Higher magnification of the neurone shown in (C). (E) Elongated neurone (about 400 μm from the labelled follicle) along a thin nervous fascicle (arrowhead). (F) Higher magnification of the neurone shown in (E). (G,H) Two labelled neurones with an ovoid shape. Note that the neurones showed smoothly contoured soma and an eccentrically located nucleus (D,G,H,)

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