Lemo21(DE3) Chemically Competent Cell

 大腸桿菌化學感受態細胞

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產品組分：

菌株描述

Lemo21(DE3)菌株是一種T7菌株，特別構建專門開發適用于困難蛋白的原核表達，包括：膜蛋白、毒性蛋白，以及具溶解性問題的蛋白。

Lemo21(DE3)不僅含BL21（DE3）的宿主特性，而且能對困難克隆進行可調控表達。這一可調控表達通過改變溶菌酶（lysY）水平來實現，溶菌酶是T7 RNA聚合酶的天然抑制劑。溶菌酶的水平（0-2,000μM）通過在表達培養物中添加L-鼠李糖來調節。當 Lemo21（DE3）在不含鼠李糖的情況下生長時，該菌株的表現與含 pLysS 的菌株相同。然而，添加鼠李糖即可調節目的蛋白的表達。對于難溶蛋白，調節表達水平有可能產生更可溶的正確折疊的蛋白。Lemo21(DE3)能同時表達T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶，適用于PET，pGEX，pMAL等質粒的蛋白表達。

菌株重要特征：

1） Lon 和 OmpT 蛋白酶缺失，減少對重組蛋白的降解；

2） fhuA2突變，賦予菌株產生噬菌體T1抗性；

3） pLemo質粒（具氯霉素抗性）攜帶由鼠李糖誘導的T7溶菌酶表達框，實現目的蛋白的可調控表達；

Lemo21(DE3)菌株基因型：fhuA2 [lon] ompT gal (λ DE3) [dcm] ?hsdS / pLemo(Cam^R)

產品描述

本品是大腸桿菌Lemo21(DE3)菌株經特殊工藝制作所得的感受態細胞，可用于DNA的熱擊轉化。經pUC19質粒檢測轉化效率＞10⁸ cfu/μg DNA。且在-80℃能穩定保存幾個月轉化效率不發生改變。

保存與運輸條件：

保存：-80℃保存，六個月有效。

運輸：干冰運輸。

注意事項

1） 感受態細胞必須用干冰運輸。感受態細胞應在-80℃保存，不可反復凍融且放置時間過長，否則會減低感受態細胞的轉化效率。

2） 最好在冰上融化感受態細胞。

3） 進行轉化操作時，需在相應溫度及無菌條件下進行。

4） 轉化高濃度質?；蚋咝蔬B接產物可相應降低最終用于涂板的菌量。

5） 為防止轉化實驗不成功，可保留部分連接反應液以重新轉化，將損失降到最低。

6） 產品包裝內含載體pUC19 DNA(10pg/μl)，供對照實驗用。

7） 誘導時，IPTG濃度可選：0.1~2 mM。鼠李糖最佳濃度，誘導時間，溫度，IPTG濃度需自行優化。

8） 對毒性大的蛋白，在轉化感受態涂平板這一步應加入鼠李糖（1000 μM），以促進陽性菌落的形成，并且后面的所有步驟都應在培養基中加入鼠李糖。

9） Lemo21(DE3)菌株攜帶pLemo質粒，除復蘇培養基為無抗生素外，其余所用培養基、培養液均應含有34 μg/ml氯霉素，以防質粒丟失。

10） 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

操作流程【所有操作均在無菌條件的標準下進行】

1） 從-80℃冰箱取出感受態細胞，迅速置于冰浴中，5min后待菌塊融化，加入目的DNA（質?；蜻B接產物），用手輕彈管底輕輕混勻（避免用槍吸打），冰浴靜置25min。

2） 42℃水浴熱激45s，迅速將離心管轉移到冰浴中，冰上靜置2min。此過程不要搖動離心管。

3） 向每個離心管中加700 μl無菌的LB或2YT培養基（不含抗生素），混勻后置于37℃ 搖床，200 rpm振蕩培養60min，目的使質粒上相關的抗性標記基因表達，使菌體復蘇。

4） 低速離心收菌（比如5000rpm，1min），留取100μl左右上清，用槍輕輕吹打重懸菌塊，之后加到含所選質粒篩選抗生素的LB或2YT固體瓊脂培養基上，用無菌的涂布棒將細胞均勻涂開，將平板置于室溫（或37℃）直至液體被吸收，倒置培養，37℃培養過夜。

【注意】：

a）涂布用量可根據具體實驗調整。若預計的克隆較多，可直接吸取轉化產物涂布平板；若預計的克隆少，則同上離心（5,000 rpm，1min）后留取適量培養液，懸浮菌體后將其涂布于一個平板中。

b）新制備的固體培養基不易涂干，可將平板正置于37℃直至液體被吸收后再倒置培養。c）涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的轉化菌落數過少，可以將剩下的菌液再涂布新培養基進行培養。

c）Lemo21(DE3)菌株攜帶 pLemo質粒，除復蘇培養基為無抗生素外，其余所用培養基、培養液均應同時加入34 μg/ml氯霉素，以防質粒丟失。

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附表1 固體和液體LB培養基配方

附表2 固體和液體2-YT培養基配方

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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