Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells

細胞線(xiàn)粒體分離試劑盒

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

細胞線(xiàn)粒體分離試劑盒（Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells）是一款快速便捷的分離培養細胞內線(xiàn)粒體的試劑盒。本試劑盒在分離線(xiàn)粒體的同時(shí)，還能獲得不含線(xiàn)粒體的細胞漿蛋白，可用于分析細胞色素c等線(xiàn)粒體蛋白向胞漿的釋放。經(jīng)本試劑盒獲得的大部分線(xiàn)粒體都含有完整的內膜和外膜，且維持線(xiàn)粒體生理功能，因此，分離所得的線(xiàn)粒體可用于線(xiàn)粒體膜電位等生理功能相關(guān)研究。另外，分離得到的線(xiàn)粒體也可被線(xiàn)粒體裂解液或其它適當裂解液裂解后用于SDS-PAGE、Western、雙向電泳等蛋白分析。

產(chǎn)品組分

保存與運輸方法

保存：-20℃保存，1年穩定。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1）   進(jìn)行實(shí)驗之前務(wù)必閱讀試劑盒操作流程，根據最終實(shí)驗目的選擇試劑盒內所要用到的試劑。

2）   若不是用于制備線(xiàn)粒體蛋白樣品，不必往線(xiàn)粒體裂解液和清洗液中加PMSF。

3）   分離線(xiàn)粒體的所有步驟均需在冰上或4℃進(jìn)行，所用溶液需冰浴或4℃預冷，全部操作時(shí)間盡量控制在1h之內。

4）   通常，在分離線(xiàn)粒體時(shí)前后兩次離心速度選取1000g和15,000g，如果希望純度更高，但對線(xiàn)粒體的得率要求不高，前后兩次離心速度可以采用2000g和6000g。

5）   細胞計數（如臺盼藍染色）對于不同實(shí)驗不必全部使用，實(shí)驗條件成熟后可不用。

6）   為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

自備材料

1）（可選）胰酶-EDTA細胞消化液

2）（可選）臺盼藍染色液

3）（可選）BCA蛋白定量檢測試劑盒

4）PBS

5）低速離心機

6）勻漿器

使用方法

1.      試劑準備：從冰箱取出所需試劑置于室溫融解，之后立即置于冰上待用。需要注意，如果實(shí)驗目的是為了制備線(xiàn)粒體蛋白樣品，需在線(xiàn)粒體裂解緩沖液和清洗液內添加PMSF (100×)，使其終濃度為PMSF (1×)。PMSF一定要在試劑加入到樣品前1-2min內加入，以免PMSF在水溶液中失效。

2.      收集細胞：

2.1 對于貼壁細胞：用預冷的PBS清洗細胞1次，胰酶消化，100-200g 4℃離心5-10min收集細胞。

2.2 對于懸浮細胞：直接離心收集細胞。

3.      清洗：用預冷的PBS輕輕重懸細胞沉淀，如有必要，取少量細胞用于計數。剩余細胞600g 4℃離心5min沉淀細胞，棄上清?！咀⒁狻浚?jiǎn)蝹€(gè)樣品細胞量≥106個(gè)，一般控制在2-5×107個(gè)。

4.      裂解：往沉淀內加入1-2ml預冷的線(xiàn)粒體裂解液重懸細胞，冰內孵育10-15min，可用相差顯微鏡檢測細胞膨脹程度。

5.      勻漿：把細胞懸液轉移到Dounce勻漿器中，勻漿10-20次。不同細胞或不同勻漿器所需的勻漿次數有所不同，需自行優(yōu)化?！咀⒁狻浚和ǔ?，可以在勻漿10次后取約2μl細胞勻漿，加入30-50μl臺盼藍染色液，混勻后顯微鏡下觀(guān)察臺盼藍染色陽(yáng)性（藍色）細胞的比例。如果陽(yáng)性細胞比例不足50%，增加5次勻漿。隨后再同前取樣進(jìn)行臺盼藍染色鑒定。當陽(yáng)性比例超過(guò)50%時(shí)即可停止勻漿進(jìn)入下一步。請勿過(guò)度勻漿，過(guò)度勻漿會(huì )導致線(xiàn)粒體的機械損傷。同時(shí)記錄對于該細胞的勻漿次數，通常在后續實(shí)驗時(shí)不必再摸索勻漿次數。

6.       取勻漿液，立即加入等量清洗液，輕輕顛倒混勻數次。

7.       4℃ 1300g離心5min以去除細胞核、未破碎細胞和大的膜碎片。

8.       上清液轉移至一干凈離心管，4℃ 1000g離心5min，重復2次。

9.       上清液轉移至一干凈離心管，4℃ 12000-15000g離心15min，重復1次。

10.    棄上清，沉淀即為線(xiàn)粒體。需注意，如果希望獲得去除線(xiàn)粒體后的細胞漿蛋白，應在本步驟中收集上清，且在收集上清的過(guò)程中不要觸及沉淀，隨后把收集的上清4℃ 12000g 離心10min，此時(shí)即得到去除線(xiàn)粒體的細胞漿蛋白。

11.    保存：棄上清，用適當的緩沖液懸浮沉淀。如果用于線(xiàn)粒體酶活性或功能分析，線(xiàn)粒體沉淀需重懸于線(xiàn)粒體保存液中；如果用于細胞漿蛋白的分析，獲得的細胞漿蛋白應保存于蛋白保存液（1×），即按照：細胞漿蛋白：蛋白保存液（5×）=4：1比例混合；如果用于雙向電泳，應使用其它適宜的保存液。

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